Avhandlingar och publikationer

Cutaneous leishmaniasis – Treatment and genetic mechanismsaffecting outcome

Publicerad 23 september 2022

Hedvig Glans

Populärvetenskaplig sammanfattning

Infektionssjukdomen leishmaniasis orsakas av parasiten Leishmania och sprids genom bett av sandmyggor. 350 miljoner människor lever i områden där de kan insjukna i leishmaniasis och WHO har klassat sjukdomen som en bortglömd tropisk sjukdom (neglected tropical disease). I länder där leishmaniasis inte finns, icke-endemiska länder, ses sjukdomen framför allt hos resenärer, som varit i områden med leishmaniasis, och hos migranter, som lämnat områden med leishmaniasis.

Parasiten infekterar människan genom bett från infekterade sandmyggor. När sandmyggan suger blod, injiceras parasiten i människan. Väl inne i människan, lyckas parasiten undgå det immunförsvar som ska döda främmande mikrober och överlever. Beroende på undergrupper inom Leishmania-släktet kan den smittade personen få olika sjukdomsbilder. Kutan leishmaniasis är en lokal infektion i huden som leder till ett långdraget sår, som på sikt läker till ett stigmatiserande ärr. Visceral leishmaniasis är en systemisk infektion där parasiten har spridit sig i hela kroppen och flera organ. Det är den allvarligaste formen av leishmaniasis och upptäcks den inte i tid och behandlas leder den till döden. Mukokutan leishmaniasis är en destruktiv form med sår i slemhinnorna i näsa, svalg och hals.

Leishmania har en livscykel som består av två stadier, en i sandmyggan och en i värddjuret, människan. Reproduktionen i sandmyggan sker framför allt genom celldelning (mitos), men även sexuell reproduktion (meios) och utbyte av arvsmassa vid celldelningen är beskrivna. Genom det genetiska utbytet i sandmyggan kan parasiten skapa hybrider med olika genetiska uppsättningar. Detta är inte en vanligt förekommande händelse hos Leishmania, men verkar ha varit gynnsamt för parasiten för att kunna anpassa sig till miljöförändringar. Det förekommer hybrider med arvsmassa från samma och olika undergrupper inom Leishmania-släktet.

Människans celler är diploida – de har två uppsättningar av kromosomer. Hos Leishmania-parasiten ser man ofta en diploid uppsättning kromosomer men även en variation i antal kromosomer, fler än två, vilket kallas ”aneuploidi”. I en population av Leishmania finns även en variation i antal hela och/eller delar av kromosomer. Denna variation kallas ”mosaisk aneuploidi”. Utbytet av genetiskt material under sexuell reproduktion anses kunna vara en förklaring till detta fenomen. Genom variationer i antalet kopior av DNA (copy number variation) kan Leishmania duplicera gensekvenser och/eller kromosomer och påverka det specifika genuttrycket. Leishmania verkar använda sig av detta för att anpassa sig vid miljöförändringar och stress, som till exempel vid läkemedelsbehandling.

I vår första studie tittade vi på hur arvsmassan/genomet hos Leishmania tropica ser ut när det gäller utbyte av genetiskt material, hybrider och mosaisk aneuploidi. Vi fann flera tecken på utbyte av genetiskt material och flera hybrider. Vi kunde koppla dem till olika genetiska träd och anfäder. Variationen hos våra isolat var större än tidigare studier visat och bland våra isolat kunde vi se en geografisk skillnad mellan isolat från Afghanistan, Iran och Syrien. Det genetiska utbytet var större bland isolaten från Syrien.

I studie II undersökte vi om det fanns några skillnader i arvsmassan mellan de isolat som blivit exponerade för läkemedlet antimon jämfört med dem som inte blivit det. Vi undersökte hela genomet samt specifika gener som tidigare studier har kopplat ihop med läkemedelsresistens. Vi fann en ökad variationsfrekvens i basparen (enbaspolymorfi, single nucleotide polymorphism) i arvsmassan hos vissa isolat, framför allt bland dem från Afghanistan och Iran, där variationen även skulle kunna påverka genuttrycket på aminosyre/protein-nivå. Någon koppling till tidigare behandling med antimon syntes inte. Vi undersökte även vilka gener som ökat i antal, via copy number variation, och fann att flera gener kopplade till livsnödvändiga funktioner för cellöverlevnad hade amplifierats efter behandling med antimon. Tidigare publicerade gener kopplade till läkemedelsresistens var inte amplifierade. Troligtvis använder Leishmania flera olika genetiska mekanismer för att anpassa sig till miljöförändringar och selektionstryck från läkemedel.

Förstavalsbehandlingen av leishmaniasis har länge varit läkemedlet antimon. Under de senaste årtiondena har man sett en ökad resistensutveckling vid behandling, i form av terapisvikt och återfall efter avslutad behandling. Detta har lett till nya behandlingar, som inte är lika väl beprövade i endemiska områden, men där mindre behandlingsstudier visat goda resultat med utläkning.

Vi ville i studie III och IV undersöka vilken behandling patienter med leishmaniasis i icke-endemiska länder i Europa får och hur de läker ut. I studie III undersökte vi hur Sverige omhändertar patienter med leishmaniasis. Under en 20-års-period var kutan leishmaniasis den vanligaste formen i Sverige. Personerna som insjuknade var framför allt migranter från Syrien och Afghanistan, medan svenska resenärer oftast hade blivit infekterade i Sydamerika. Antal fall ökade mellan 2013 och 2016, kopplat till ökad migration från endemiska områden. Majoriteten påbörjade sin behandling inom de första månaderna efter första sjukvårdskontakten. Utläkningen efter behandling stämmer överens med kunskapsläget inom forskningsfältet.

I studie IV jämförde vi behandling och utfall hos patienter i Europa som fått diagnosen kutan leishmaniasis orsakad av Leishmania major eller Leishmania tropica. Vi ville undersöka skillnader i behandling och utläkning. Personer infekterade med L. major hade oftast besökt Nordafrika för att hälsa på släkt och vänner medan personer infekterade med L. tropica var migranter från Syrien och Afghanistan. Behandlingsval var i linje med rådande europeiska riktlinjer från 2014 och utläkningen vid behandling med antimon var jämförbar med tidigare studier. Behandlingseffekten med liposomalt amphotericin B var däremot lägre och miltefosine hade en hundraprocentig utläkningseffekt. Fler studier av dessa två behandlingsval behövs för att bekräfta våra resultat.

Målet med denna avhandling, bestående av fyra delprojekt, var att öka kunskapen kring leishmaniasis genom att bättre förstå vilka genetiska mekanismer parasiten använder för att anpassa sig till nya miljöer och överleva stressen vid läkemedelsexponering, och hur hybrider kan anpassa sig till nya arter av sandmygga och nya miljöer samt undersöka hur god vård leishmaniasis-patienter får i icke-endemiska länder i Europa, inklusive Sverige. Ett annat mål var att öka kunskapen kring L. tropica-parasitens komplexa genom, som förändras genom flera genetiska mekanismer och hur det kan tänkas påverka behandlingsresultatet.

Sammanfattning

Cutaneous leishmaniasis is a neglected tropical disease with several knowledge gaps, ranging from the Leishmania parasite to treatment outcome. This creates a complex picture where our research has tried to enhance the understanding of CL caused by L. tropica.

The L. tropica genome has a high genetic diversity, with heterozygosity and aneuploidy, consistent with genetic exchange and several genetic mechanisms for adaptation to environmental changes and drug pressure.

I. Recombination creates intra- and interspecies, hybrids, which can adapt to new environments and use new vectors. L. tropica can use several vectors, to maintain its lifecycle and transmission, and can spread over large geographic areas. Our findings indicate an increased hybridisation and new progeny with genetically highly similar or distinct Leishmania. The genetic mixing from diverse ancestries and the hybrids among our isolates, may be an explanation of the challenges in treating CL with L. tropica in the Middle East. To better understand this, further research is needed.

II. Several genetic loci and mutations related to drug resistance, such as the H locus, have been reported for other Leishmania spp. We could not find any CNV on genes correlated with antimonial resistance, although, the isolates from Syria had an increased frequency of non-synonymous SNPs at the H locus. These SNPs could indicate a pre-adaptation to antimonials among the parasites in the region.

III. When comparing CNVs among isolates with or without previous exposure to antimonials, exposed isolates showed amplification of several genes involved in essential cellular functions to survive. These functions included oxidative stress reduction, DNA repair after oxidative damage, the trypanothione pathway for reducing oxidative stress, maintenance of cell wall stability, iron and heme metabolism and parasite viability and virulence.
Our findings enhance knowledge of the complex genetic picture of L. tropica, with several genetic mechanisms used to survive environmental changes and genetic recombination enhancing the chance of survival at a group level.

IV. The numbers of leishmaniasis cases included in the studies were affected by the political situation in Europe and neighbouring regions during the time of inclusion, which encompassed the 2015 European refugee crisis. In Sweden, the number of leishmaniasis cases increased between 1996 and 2016, mainly among migrants from endemic countries, especially Syria.
The majority of CL patients infected with L. major were infected while visiting friends and family in North Africa, whereas CL patients infected with L. tropica in Europe during 2013–2019 were mainly migrants from Syria. This may also reflect different living conditions. Sandfly behaviour may influence the possibility to protect people against being infected.

V. CL is rare diagnosis in Sweden and Europe. In our studies, patients were treated in accordance with then current European guidelines. Most CL patients were treated with pentavalent antimony, intralesional or systemic depending on lesion size, number and location, and with a cure rate in line with those seen in previous studies. Our conclusion drawn here was that antimonials can still be used as first-line treatment for travellers and migrants in non-endemic countries in Europe with CL with L. major and L. tropica when the infection has been acquired in Africa or the Middle East. Cryotherapy and liposomal amphotericin B also had cure rates similar to those in previous studies.

Treatment and outcome in our studies were in line with guidelines. Still, larger randomized clinical trials are desirable for the evaluation and optimisation of treatment. Studies are difficult to perform in non-endemic areas due to the limited number of cases. In Sweden, 164 patients with leishmaniasis were identified during a 20-year period and in Europe, 207 CL patients were included.